rubicon SMARTer® microRNA-Seq 文庫構建

microRNA-Seq（for Illumina）

品牌    Code No.     包裝量     價格

Clontech R500653 16 Rxns    9,896 元  

Clontech R500654 48 Rxns    27,036 元   

Clontech R500655 96 Rxns    48,771 元

 歡迎您致電 華雅再生醫(yī)學旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術有限公司  181 6644 1624。紅榮微再-客服 1022 355 724  

SMARTer® microRNA-Seq Kit

SMARTer® microRNA-Seq Kit：實現(xiàn)高準確性、特異性和再現(xiàn)性的small RNAs 和microRNA分析

· 采用的MAGIC技術減少偏差，獲得準確且重復性好的small RNA和miRNA分析

· 以100 ng-1 μg的總RNA或2-200 ng富集的小RNA樣品起始，高靈敏度的制備文庫

· 簡單的單管操作，6小時內(nèi)制備高質(zhì)量的小RNA文庫

SMARTer microRNA-Seq Kit專門用于構建高質(zhì)量microRNA（miRNA）的Illumina測序文庫。使用*的MAGIC技術（Mono-Adapter liGation and Intramolecular Circularization），以100 ng- 1 μg總RNA或2-200 ng富集小RNA（包括miRNA）樣本量起始，減少接頭連接帶來的偏差。這項創(chuàng)新技術使SMARTer microRNA-Seq Kit能夠以高重現(xiàn)性，高準確性和高靈敏度捕獲小RNA和miRNA ，確保研究結果的*性和可靠性。此外，該試劑盒的另一個特點是簡便的單管操作流程，可在不到6小時成功生成文庫，操作方便的同時降低被污染的風險。

SMARTer microRNA-Seq試劑盒：

甚至可以捕獲microRNA以獲得準確的microRNA表達譜
Mono-adapter連接和分子內(nèi)環(huán)化技術可以大限度地減少偏差

和競爭對手比較：

比Illumina，NEB，Bioo和QIAGEN方法有更高的靈敏度和準確度

可靠地捕獲輸入源和數(shù)量的小RNA種類可
重復的結果可以更好地反映樣品的真實生物狀態(tài) 

介紹：

在細胞調(diào)節(jié)過程中，小的非編碼RNA（長度在15到200個核苷酸之間）在調(diào)節(jié)遺傳信息流動中起著關鍵作用（Phillips 2008）。它們能夠調(diào)節(jié)RNA剪接和蛋白質(zhì)翻譯，通過改變?nèi)旧|(zhì)結構影響DNA復制，以激素樣方式介導細胞間通訊，并參與基因組防御（Bayraktar，Van Roosbroeck和Calin 2017; Phillips 2008; Tao等2017）。雖然存在多種類型的小非編碼RNA，但microRNA的調(diào)節(jié)作用 - 通過以序列依賴性方式與靶mRNA結合起作用 - 是熟知和研究的。

MicroRNA測序是研究人員檢查microRNA表達模式，表征新型microRNA和揭示疾病相關microRNA的有用工具。由于microRNA在一系列標本（例如尿液，F(xiàn)FPE組織）中異常良好地保存，因此分析它們的表達可以作為強有力的診斷工具（Stuopelyte等人2016; Kakimoto等人2016）。然而，用于測序微小RNA的大多數(shù)方法涉及連續(xù)的分子間連接事件。這些事件引入了相當大的系統(tǒng)性偏倚，導致許多前瞻性生物標志物的丟失或過度表現(xiàn)，因此庫不是起始樣品的真實反映（Fuchs等，2015; Raabe等，2014）。

我們近開發(fā)了SMARTer microRNA-Seq Kit，它使用M ono- A dapter li g ation 和I ntramolecular Circularization（MAGIC）技術可有效捕獲具有極低偏差的microRNA種類（圖1）。通過連接制備文庫，但是，不是經(jīng)歷兩個連續(xù)的分子間連接事件，微小RNA在其3'末端接受單個組合銜接子。該適配器（在反應中剩余的，未連接的銜接子小化之后）允許microRNA通過與底物分子的5'-末端的環(huán)化事件側接兩個獨立的銜接子。將側翼適配器的環(huán)狀微小RNA逆轉錄，并使用用于Illumina測序平臺的條形碼索引引物對cDNA進行PCR擴增。

圖1. MAGIC技術原理

圖2. 使用SMARTer microRNA-Seq kit高準確性高靈敏度分析miRNA

（以上比較數(shù)據(jù)來源于Takara Bio Inc.）

取由963種合成miRNA等摩爾混合后制成的miRNA Pool，分別使用本試劑以及其他4家公司的同類產(chǎn)品（接頭連接法）制備文庫，然后進行測序，比較這幾種文庫miRNA的表達量。使用本kit制備的文庫比其他4種基于接頭連接法的同類產(chǎn)品更準確，且獲得的基因檢測數(shù)更多。

Panel A： microRNA表達水平（Y軸，對數(shù)標度），每種miRNA（X軸，按照表達水平排序）。將假想的表達量水平全部設置為1進行均一化，以上下相差2倍作為cutoff值，顯示了cutoff值范圍內(nèi)的miRNA表達量的比例。

Panel B：分析了每百萬不同計數(shù)檢測到的microRNAs數(shù)量，X軸為不同計數(shù)閾值，Y軸為對應檢測到miRNA數(shù)量。

SMARTer方法可在輸入源和數(shù)量之間產(chǎn)生高度可重復的結果

為了評估SMARTer microRNA-Seq試劑盒在多種總RNA來源和輸入量上的表現(xiàn)，使用來自已知含有不同microRNA表達水平的四種來源的100 ng或1μg總RNA（RIN> 8）制備文庫（如表I中所述，在2％和13％之間：人腦，人胎盤，人脾和miRQC研究中使用的通用參考RNA樣品（Mestdagh等人，2014）。表I中顯示的測序指標表明輸入源和數(shù)量的*結果。

所有文庫都顯示在輸入水平和來源的緊密范圍內(nèi)（~48-71％）映射到hg38。當microRNA讀數(shù)被定位到miRbase并以總讀數(shù)的比例表示時，結果顯示每個輸入量的RNA源之間的*映射。此外，SMARTer文庫制備可以捕獲其他小RNA種類（統(tǒng)稱為piRNA，snoRNA和snRNA），并且不會丟失對rRNA的許多讀數(shù)。這種趨勢也可以用較低的輸入量（1-10ng總RNA;數(shù)據(jù)未顯示）看到，盡管這些樣品遭受可能影響測序質(zhì)量的增加的銜接子 - 二聚體污染。文庫制備顯示在5X或更高讀數(shù)下檢測到的相似數(shù)量的microRNA，無論microRNA比例如何（數(shù)據(jù)未顯示），表明有效且較少偏向的microRNA捕獲。

表1.不同組織來源的RNA的分析結果

以四種microRNA含量不同的100 ng和1 μg的總RNA起始，分別進行文庫分析。通過起始量多少的比較，結果顯示microRNA reads在total reads的占比結果相差不大。此外，除miRNA之外還可以檢測到其他小RNA（piRNA，snoRNA，snRNA），但是檢測到的rRNA的比例不高。

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結論  

微小RNA是一類小的非編碼RNA，可作為基因表達的關鍵轉錄后調(diào)節(jié)因子。由于其在維持細胞功能中的關鍵作用，失調(diào)的miRNA表達涉及許多疾病狀態(tài)，提高了使用microRNA作為生物標志物的可能性（Wang，Chen和Sen 2016）。因此，準確查詢microRNA表達的能力對于當前和未來的科學進步（包括治療和臨床診斷）是重要的。為此，我們開發(fā)了一種方法，通過利用分子內(nèi)環(huán)化（MAGIC技術）向microRNA添加適配器，大限度地減少microRNA文庫制備中連接誘導的偏倚。這導致顯著更低的連接偏差并提供樣品中真實microRNA表達的準確概況。

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